დნმ-ის ექსტრაქციისთვის ლობიოს მარცვლები წმინდად დავფქვით და დნმ-ის ექსტრაქციისთვის ავწონეთ 50-50 mg მასალა, რომელიც მოვათავსეთ 2ml-იან ეპენდორფის ტიპის სინჯარაში. ექსტრაქციისთვის გამოვიყენეთ CTAB მეთოდი, რომელიც მდგომარეობს შემდეგში:
დნმ-ის ექსტრაქციის CTAB მეთოდი
100mg ჰომოგენიზებულ საექსტრაქციო ნიმუშს ემატება 500μl CTAB ბუფერი (20g CTAB/l, 1.4 NaCl, 0.1M Tris-HCl, 20mM EDTA) და 20μl პროტეინკინაზა K (20mg/ml). 65˚C-ზე 1სთ-ით ინკუბაციის შემდეგ ემატება 20μl რნმ-აზა A (10mg/ml) და ხდება ინკუბაცია 65˚C-ზე 10წთ-ის განმავლობაში. ცენტრიფუგირება ხდება 16000xg-ზე 10წთ-ის განმავლობაში. სუპერნატანტი მუშავდება 500μl ქლოროფორმით ორჯერ. ზედა ფაზა გადაგვაქვს ახალ სინჯარებში და ვამატებთ ორ მოცულობა CTAB პრეციპიტაციურ ხსნარს (5g/l CTAB, 0,04M NaCl) და ვაინკუბირებთ 1სთ-ის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. შემდეგ ხდება ცენტრიფუგირება 16000xg-ზე 5წთ-ის განმავლობაში, სუპერნატანტს ვღვრით და ნალექს ვხსნით 350μl 1.2M NaCl-ში და ვამატებთ 350μl ქლოროფორმს. შემდეგ 16000xg-ზე 10წთ-ის განმავლობაში ხდება ცენტრიფუგირება, ზედა ფაზა გადაგვაქვს ახალ სინჯარებში, ვამატებთ 0,6 მოცულობა იზოპროპანოლს, ვაჩერებთ 10წთ-ის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე და ვაცენტრიფუგირებთ ხსნარს მაქსიმალურ სიჩქარეზე 10წთ-ის განმავლობაში. ვღვრით სუპერნატანტს და ნალექს ვრეცხავთ 500μl ეთანოლით (70% v/v). ცენტრიფუგირების შემდეგ სუპერნატანტს ვღვრით ფრთხილად, ნალექს ვაშრობთ და დნმ-ს ვხსნით 100μl დეიონიზებულ წყალში.
დნმ-ის შეფასება ხდება აგაროზას გელზე ელექტროფორეზით და მიღებული შედეგის ვიზუალიზაციას ვახდენთ ულტრაუიისერი სხივების ქვეშ.
ლობიოს გენომური დნმ-ები
1. შავი;
2. კუტი (საკონტროლო);
3. კუტი ჭრელი;
4. გურული (საკონტროლო);
5. თეთრი.
მიღებულ დნმ-ებზე ჩავატარეთ პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია, სადაც გამოყენებულ იქნა მცენარესპეციფიური პრაიმერი (გამოყენებადია ყველა მცენარის დნმ-ის ამპლიფიკაციისთვია), რომელიც ახდენს მცენარის ქლოროპლასტული დნმ-ის გარკვეული მონაკვეთის ამპლიფიკაციას. აღნიშნული პრაიმერი გვაძლევს განსხვავებული ზომის PCR პროდუქტს სხვადასხვა მცენარეული დნმ-ის ამპლიფიცირებისას, რომელთა ზომებიც მერყეობს 400-650bp-ის ფარგლებში.
PCR – ქლოროპლასტული დნმ-ის პრაიმერი
1. შავი;
2. კუტი (საკონტროლო);
3. კუტი ჭრელი;
4. გურული (საკონტროლო);
5. თეთრი;
6. უარყოფითი კონტროლი;
7, მარკერი.
ავტორი: გიორგი ბადრიშვილი
იხილეთ აგრეთვე: ლობიო – ლობიოს თესვა, მოყვანა
